제 5장 유전자 재조합 - 벡터와 삽입DNA를 접합

6. 재조합체 DNA 구성법

 

재조합체(recombinant) DNA를 만드는 기술을 recombinent DNA technology라고 한다.

 

재조합체DNA란, 운반체인 vector DNA에 원하는 외래(foreign) DNA를 공유결합시켜 만든 것이다.

 

유전자 재조합 기술을 이용해 하나의 생물체에서 다른 생물체로 유전정보를 전달할 수 있다.

 

 

접착성 말단 연결법

 

vector DNA와 외래 DNA을 같은 종류의 제한효소로 절단시키면 같은 모양의 말단을 갖는다.

 

말단은 단일가닥으로 서로 상보적인 염기쌍을 이루는데, 분해된 두 종류의 DNA를 섞고

 

DNA ligase를 처리하면 5'인산기와 3'-OH기 사이에 공유결합이 이루어지면서 연결된다.

 

 

 

DNA를 제한효소로 분해했을 때 평활성 말단이 생기거나  같은 제한효소를 이용할 수 없을 때  tail이나 링커를 이용하면 효과적이다.

 

1. homopolymer tail 호모폴리머 테일

 

먼저, 각 DNA 말단에 같은 종류의 nucleotide를 여러개 결합해 homopolymer tail을 만든다.

 

이들 염기쌍이 스스로 서로 상보적인 수소결합을 이룬 다음, DNA ligase를 처리해 하나의 DNA분자로 공유결합 되도록 하는 방법이다.

 

 2. linker 링커

 

nucleotide 10개 내외로 연결된 DNA 조각.

 

그 자체 내에 특정 제한효소에 의해 인식, 절단되어 접착성 말단을 형성할 수 있도록 인위적으로 합성한 것.

 

다시말해, vector나 외래DNA의 말단에 linker를 연결한 다음, 제한효소로 linker 내부를 절단한다.

 

이렇게 생긴 접착성 말단에 있는 염기쌍 사이에 서로 수소결합이 이루어지도록 한 다음,

 

DNA ligase를 처리해 vector와 외래DNA를 이인산에스테르 공유결합으로 연결하는 방법.

 

 

3. cDNA 합성법

 

일단, cDNA는 어떻게 만들어지는가. DNA를 transciption해서 mRNA를 생성한다. -> mRNA를 역전사효소로 cDNA를 만들어진다. 

 

cDNA합성법은 진핵세포로부터 유전자를 분리 클로닝하기 위해 이용되는 중요한 방법이다.

 

진핵세포의 DNA는 인트론과 엑손 부분으로 되어있는데, 인트론 DNA는 제거하고, 엑손(발현되는 부분) DNA 부분만 선별해 합성하고 분리할 수 있다.

 

먼저, 세포를 파괴해 mRNA를 선별적으로 분리한다. 분리된 mRNA에 역전사 효소를 처리해 단일가닥의 cDNA를 합성한다.

 

약품처리로 mRNA와 cDNA를 분리해 RNA만 제거하면 cDNA만 남는다.

 

이 cDNA에 DNA폴리머레이즈를 이용해 새로운 가닥의 DNA사슬을 합성한다. 이중가닥의 cDNA가 만들어진다.

 

이중가닥 cDNA는 적절한 vector DNA에 결합시켜 클로닝될 수 있다.