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제 3장 효소 및 효소반응

5. 효소반응의 영향인자

1) pH와 이온강도

단백질인 효소들은 아미노산으로 구성되어 있다. 아미노산은 아미노기와 카르복실기를 갖고 있어 수용액 속에서는 이온 상태로 존재한다.

이온은 효소의 촉매기능을 위해 적합한 형태(산성 또는 염기성)으로 존재해야 한다.

즉, 반응액의 pH가 변하면 활성부위의 이온형태가 변화하고, 효소의 활성도가 바뀌면서 결국 반응속도도 변한다.

또한 기질의 전하에도 영향을 미쳐 효소의 기질 친화력(Km)에도 변화를 준다.

최적 pH는 효소마다 다르다.

2) 온도

효소반응에서 온도가 상승하면 반응속도도 증가한다. 반응속도식에서 온도의 영향을 받는 인자는 반응속도 상수(K)이다.

그러나 생물촉매인 효소는 특정 온도 이상이 되면 단백질의 비가역적 불활성화로 생리적 활성을 잃게 된다.

효소 반응에서는 효소활성이 제일 큰 최적 온도가 있으며, 활성을 잃게 되는 한계 온도가 있다.

보통 효소의 한계온도는 70-80'C이고, 최적온도는 20-50'C 사이이다. 이 온도 범위에서는 온도 증가에 따라 반응 속도가 증가한다.

이는 Arrhenius 식으로 설명할 수 있다.

효소에 의한 촉매반응의 속도는 일정 한계까지 온도에 따라 증가한다.

이 온도 영역은 활성화 에너지가 증가하는 영역이며, 온도활성화 영역이라고도 한다.

위의 효소반응에서 전체 효소반응속도를 두번째 단계(ES -> E + P)에서 결정한다면

반응속도는 속도상수 k2와의 관계식으로 아래처럼 표현 가능하다.

SAMMRY

위 효소반응에서 전체 효소반응속도를 두번째 단계에서 결정한다면 반응속도는 속도상수인 k2와의 관계식으로 표현할 수 있다.

이러한 반응속도의 온도의존성은 활성화 에너지(Ea)의 크기에 따라 결정된다.

활성화에너지(Ea)값이 큰 반응은 기울기가 크므로 온도변화에 민감하고, 활성화에너지가 낮은 반응은 온도변화에 대해 덜 민감하다.

이러한 특성을 활용한다면 온도에 따라 원하는 반응을 선택적으로 진행시킬 수 있도록 반응조건을 선택할 수 있다

.

아래 두 그래프는 효소활성도의 온도 의존성을 나타냈다.

속도상수 k2는 특정온도 내에서 온도가 증가할수록 지수적인 증가를 볼 수 있다.

3) 저해제

효소 반응액 중에 존재하는 물질들은 효소의 기질 특이성, 활성 부위의 성질, 효소 분자의 주요 기능 부위에 영향을 미쳐 효소의 활성도를 감소시킨다.

비가역적 저해반응은 납, 수은 등의 중금속 이온이 효소 저해반응을 일으키는 저해제 역할을 한다.

중금속 이온은 효소의 아미노산 잔기들과 강력하게 공유결합하여 제거가 힘들다.

이때 EDTA, 구연산 같은 chelating agent들의 도움으로 가역화시킬 수 있다.

가역적 저해반응은 경쟁적, 비경쟁적, 반경쟁적 세가지 형태로 나뉜다.

(1) 경쟁적 저해(competitive inhibition)

저해제는 기질과 구조적 유사성을 갖고 있다. 기질 대신에 효소 활성부위에 결합해 효소-저해제 복합체를 형성한다.

즉, 효소의 활성부위 자리를 놓고 기질과 저해제가 서로 경쟁하기때문에 경쟁적 저해라고 한다.

저해제가 효소에 결합한 만큼, 정상적인 효소가 줄어든다.

이는 효소의 기질친화력을 떨어뜨려 Km을 증가시키지만, 최대반응속도 Vm에는 영향을 주지 않는다.

다만, 똑같은 반응속도를 내기위해서는 더 많은 기질이 필요하다. (Km을 증가)

(2) 비경쟁적 저해(noncompetitive inhibition)

효소 활성부위에 직접 결합하지는 않고, 효소의 다른 부위에 결합한다.

효소의 분자구조가 변화되어, 기질의 효소에 대한 친화성을 감소시킨다.

기질의 농도를 아무리 증가시켜도 해결되지 않고 최대반응속도 Vm을 떨어뜨린다.

납, 수은 등 중금속 이온이 비경쟁적 저해제로 작용한다.

(3) 반경쟁적 저해(uncompetitive inhibition)

저해제가 효소 친화력이 없어 효소에 결합하지 않는다.

대신 효소-기질 복합체(ES 복합체)에만 결합해, 효소-기질-저해제 복합체를 형성하고

최대반응속도 Vmax와 Km을 감소시킨다.

(4) 그외

공급된 기질의 양이 많으면 이 또한 효소반응에 영향을 준다.

과잉 기질에 의해 효소의 반응 속도가 줄어드는 것을 기질저해(substrate inhibition)이라 한다.

기질 농도가 증가함에 따라 반응 속도가 증가하다가 일정 상수(최대치)에 도달하면 반응속도는 줄어들기 시작한다.

이 그래프는 기질 농도변화에 따른 효소 반응속도를 나타낸다.

기질농도가 높을 때, 최대 속도 Vm이 된다.

[S] < Km : 기질 농도가 낮을 때에는 놀고있는 효소들이 존재해서 기질을 넣어주면 반응속도가 빨라진다.

[S] > Km : 기질농도가 일정 수준 이상으로 높아지면, 반응할 수 있는 효소는 한계가 있어서 속도에 변화가 크지 않다. 기질의 의존성이 낮아짐(포화효과)

최대 반응 속도(Vmax)는 초기 효소농도에 비례하고 기질농도의 증가에는 무관하다는 것을 알 수 있다.

효소반응속도를 나타내는 방법 두가지는

1) Michaelis-Menten 식(빠른 평형 가정)   2) Briggs-Haldane식(유사 정상상태 가정)이다.

1) Michaelis-Menten 식(빠른 평형 가정)

이 식에서는 기본적인 가정이 있다.

가정1. 효소에 의한 반응은 효소-기질 복합체(ES Complex)를 형성하는 결합단계가 필요하다.

가정2. 측정된 반응의 초기 속도는 항정상태(steady state)를 반영한다.

여기서 항정상태란, [ES]의 농도가 일정하게 유지되는 상태를 의미한다. 이는 모든 효소가 포화되어 있다는 가정하에 설립된다.

효소에 의한 화학반응 식은 아래와 같다.

 (3-1)

E+S -> ES

여기 첫번째 반응에서 ES복합체는 빠르게 형성되며, 가역적으로 평형상태에 있다. 

ES -> E + P

두번째 반응에서 전체 반응 속도가 좌우된다.

전체 반응의 속도는 두번째 반응에 의해 좌우되기 때문에 다음과 같이 나타낼 수 있다.

 (3-2)

첫번째 반응에서 정반응의 속도와 역반응의 속도가 동일하다는 전제로 나타낸 표현식은 아래와 같다.

           (3-3)

가정1에서 전체 효소 농도[E0]은 유리상태의 효소(어떤 기질과도 반응하지 않은) [E]와 ES복합체 형성에 사용된 효소 농도[ES]의 합이다.

                             (3-4)

식(3-4)의 [E0]를 식(3-3)의 [E]에 대입해서 풀면 아래와 같은 식이 나온다.

                           (3-5)

식(3-5)의 [ES]를 식(3-2)의 [ES]에 대입하여 풀면

                           (3-6)

최대 반응속도(Vmax)는 k2[Eo]로서 초기 효소 농도에 비례하고, 기질 농도에는 무관하다.

식(3-1)의 첫번째 반응에서 [ES]의 해리상수 Km=[E][S] / [ES] = k-1 / k1이다.

이는 다음과 같이 정리할 수 있다.

이 식을 Michaelis-Menten식이고, Km은 Michaelis-Menten 상수라 한다.

Michaelis-Menten 상수 Km이 작다는 것은 k1 > k-1 이라는 뜻이고, 이는 기질에 대한 효소의 친화력이 크다는 뜻이다.

여기서 잠깐!

"미카엘 식을 이용해 vmax과 km값을 구하시오." 라는 유형의 문제가 출제될 수 있음

2) Briggs-Haldane식(유사 정상상태 가정)

여기서는 효소반응은 정상상태(상태를 항상 유지하는 것, 정지상태 아님)를 가정한다.

식(3-1)에서 중간체인 ES복합체의 생성속도와 분해속도가 동일하다는 것으로, 이는 아래 식으로 나타낼 수 있다.

여기서 [ES]에 대해 정리를 하면, 아래의 식이 된다.

식(3-4)의 [E] = [E0] + [ES] 를 여기에 대입하고,

이를 풀어서 정리하면 [ES]에 대해 정리를 하면

이를 식(3-2)의 v = k2[ES] 에 대입하면, 아래처럼 Briggs-Haldane식이 된다.

여기서

,    라고 하면

이 되고,

라는 결론이 나온다.

여기 이해 못함...

여기서 Michaelis-Menten 식(빠른 평형 가정)과 Briggs-Haldane식(유사 정상상태 가정)는 K'm가 다르다.

k2가 k-1에 비해 작다면 즉, ES 복합체의 해리속도가 생성물의 생성속도에 비해 크다면 Km=K'm이 된다.

vmax는 효소의 고유 속도 상수 k2와 초기 효소농도(E0)에 비례하며,

K'm은 기질에 대한 효소의 찬화력에 대하여 역의 상관관계를 갖되 효소와 기질의 종류에 의해 결정되는 고유 상수값이다.

두개의 가정을 비교해보면, 어느 것을 사용해도 동일한 결과가 유도되는 것을 알 수 있다.

Michealis-Menten에는 여러개의 속도식이 있다.

아래는 Vmax와 Km에 따른 그래프 세가지이다.

     Linearweaver-Burk plot

    Eadie-Hofstee plot

    Hanes-Woolf plot

제 3장 효소 및 효소반응

1. 효소

촉매는 자신은 변하지 않고, 반응을 도와주는 역할을 한다.

효소란, ‘생물학적 반응에 촉매로 작용하는 고분자 단백질＇이다. 즉, 효소는 생체 촉매이다.

생체 내에서 단백질은  세포질에 들어 있고, 이들 대부분은 효소이다.

효소는 기질과 결합해 효소-기질 복합체(ES complex)를 형성하며, 반응의 활성화 에너지를 낮추는 촉매역할을 한다.

효소(Holoenzyme,홀로엔자임) = 단백질 부분(apoenzyme) + 비단백질 부분(prosthetic group)

여기서 비단백질 부분이 Ma,Ni,Zn,Fe,Mn 등 무기이온이 오는 경우, 보조인자(cofactor)라 하고,

NAD,FAD,CoA,thiamine pyrophosphate 등 비타민과 결합한 경우, 보조효소(coenzyme)이라고 한다.

단백질 부분만 있거나 비단백질 부분만 있으면 생물학적 활성을 띄는 효소의 역할을 하지 못한다.

미생물(microorganism)이란, 맨 눈으로는 관찰할 수 없는 작은 생물이다.

동물계 미생물과 식물계 미생물로 나뉘는데, 일반적으로 미생물 반응공정에 이용되는 유용한 미생물은 식물계에 속한다. 

미생물의 분류

미생물 분류의 기본단위는 '종(species)'이고, 유사한 종이 모여 '속(genus)'을 이룬다.

속보다 큰 단위는 과(family), 목(order), 강(class), 문(phylum 또는 division), 계(kingdom)로 구분된다.

체계(hierarchy):  

역(domain), 계 (kingdom), 문 (phylum 또는 division), 강 (class), 목 (order), 과 (family), 속 (genus), 종 (species)

생물계는 동물, 식물, 원생생물로 나누고, 미생물은 원생생물에 포함시킬 수 있다.

미생물은 다시 동물이나 식물과 같이 분화된 핵을 갖는 진핵생물(eucaryote; true nucleus)과

원시상태의 핵을 갖는 원핵생물(procaryote; before nucleus)로 나뉜다.

원핵생물은 진정세균(euvacteria)과 고세균(archae-bacteria)으로 세분된다.

여기서 질문!!)

원생생물(Protista)는 eukaryota(유케리오트)인가 Prokaryota(프로케리오트)인가??

eukaryota(유케리오트)!!

<additional point>

원핵과 진핵의 차이를 확실히 구분하고, 차이점을 알아야 나중에 공정과정을 이해하기가 수월해진다.

원핵세포와 진핵세포의 차이

-진핵생물에 널리 분포하는 인트론(intron)이 원핵생물 유전자에는 발견되지 않는다.

-진핵세포는 미토콘드리아, 골지체와 같은 다른 organism이 존재한다.

<additional point> 식물세포와 동물세포의 특징도 정리하기!!

미생물의 종류 (주로 생물화학공학에서 쓰이는 미생물 위주로 공부할 예정)

미생물의 분류는 주로 형태학적인 차이에 의해 구분된다. 여기서 주로 광학현미경이 이용된다.

세포의 외부구조는 주사전자현미경에 의해, 내부구조는 투과전자현미경이 발달함에 따라 상세히 밝혀지고 있다.

1. 세균(bacteria, 박테리아)

- 외형적인 형태에 따라 이름을 명명

구형의 구군(coccus,코커스) / 원통형의 간균(bacillus,바실러스) , 비브리오(vibrio) , 나선균(spirillum) 등으로 나뉜다.

- 생육 특성에 따라 두가지로 구분하는 방법

산소를 필요로 하는 호기성균 / 산소가 있을 경우 생육 저해를 받는 혐기성균으로 나뉜다.

-세포벽 구조의 차이에 따라 구분하는 방법

그람양성세균의 세포: 

그람 염색법(Gram staining)에 의해 염색이 되는 그람 양성균(Gram positive)

여러 층의 펩티도 글리칸(peprtidoglycan)층으로 두껍고 단단한 세포벽을 지니고 있다.

펩티도클리칸(단백질, 지질, 탄수화물로 구성된 지질 2중층 내막인 세포질막과 teichoic acid 와 공유결합한 층)

그람음성세균의 세포: 

그람 염색법(Gram staining)에 의해 염색이 되지않는 그람 음성균(Gram positive)

내막과 얇은 페티도글리칸 층에 의해 지지되는 외막9outer membrane)을 갖고 있다.

2. 효모(yeast, 이스트)

- 단세포, 때로는 사상 또는 위균사를 나타내기도 한다.

- 효모의 포자는 알맞은 영양과 온도에서 발아하며, 대부분 출아에 의해 번식한다.

- 세균보다 산에 강하므로 낮은 pH에서 배양하여 오염의 기회를 줄일 수 있다.

- 20~28도에서 잘 자란다.

3. 사상균(mold, 몰드)

- 실 모양의 가지로 된 균사(hyphae)로 이루어진다.

- 광합성을 하지 않고 포자를 만들어 증식하는 미생물을 총칭, 미생물 중에서 가장 진화된 부류.

- 액체배양에서는 보통 pallet를 형성하며 분열을 한다.

4. 조류(algae,알개)

- 엽록소가 있어 광합성 능력이 있고, 증식을 위해선 빛을 필요로 한다.

- 남조(blue-green algae), 녹조(green algae), 홍조(red algae), 갈조(brown algae), 규조(diatom) 등이 있다.

- 여기서 남조류는 세균으로 분류되기도 한다.

여기서 질문!!)

바이러스는 미생물에 속하는가??

Yes라고는 하는데... 음....

균체의 구성성분

- 미생물 종류에 따른 균체 성분

미생물의 균체는 화학적으로 약 80%의 수분을 함유한다.

그 외에 단백질, 탄수화물, 지질, 핵산, 비타민 및 무기물로 구성되어 있다.

균체의 화학성분은 미생물의 종류에 따라 다르다.

같은 균주라고 할지라도 배지조성, 배양시간, 증식속도 등에 의해 변동된다.

이를 통해, 배양을 할 떄 어떤 성분을 추가해야 하는지 알 수 있다.

- 균체의 구성원소와 무기물

미생물 종류에 따른 무기물 성분 중에는 P, K가 가장 많고, Ca, Mg, Na, Cl, Fe, Zn, Si 순으로 구성되어 있다.

이외의 미량원소는 Al, Cu, Mn, Co  등이 있다.

영양원의 영향

미생물의 종류에 따라 에너지원, 질소원 등으로 이용되는 물질의 종류는 다르다.

일반적으로 미생물의 영양요구성과 에너지원의 차이에 따라 미생물을 분류할 수 있다.

에너지원으로 광을 이용하는 광합성 미생물(phototroph)과

화학적 에너지원에 의존하는 화학합성 미생물(chemotroph)로 크게 나눈다.

주요 탄소원으로 co2를 이용할 수 있는 미생물을 독립영양균(autotroph)라고 하며,

유기탄소원에 의존하는 종속영양균(heterotroph)으로 구분한다.

또한, 둘 다 이용할 수 있는 미생물을 혼합영양균(mixotroph)이라고 한다.

영양요구에 의한 미생물의 분류

온도의 영향

미생물의 증식은 온도에 매우 민감하며,

균주에 따라 증식이 인정되는 최고온도-최저온도 사이의 온도 범위를 기본적 온도(cardinal tempertature)라고 한다.

이는 증식이 가능한 최저온도 / 비증식속도가 최고에 달하는 최적온도 / 증식이 가능한 최고온도로 구분한다.

미생물 증식의 온도 의존성

pH의 영향

미생물의 증식은 pH에 크게 영향을 받으며, 미생물의 종류에 따라 각각의 최적 pH가 있다.

대표적인 미생물 증식에 대한 pH의존성은 이 그림과 같다.

최적 pH를 중심으로 종(bell)모양을 이루며, 좌우 대칭형을 이룬다.

일반적으로 세균은 pH 6.5-8.0 범위인 중성 또는 약알칼리에서 잘 자라고, 효모와 곰팡이는 pH 4.0-6.0 범위의 약산성에서 잘 자란다.

미생물의 증식에 미치는 pH 영향

산소의 영향

미생물 증식에 필요한 산소 요구성의 유무와 강약에 따라 분류할 수 있다.

편성 혐기성균(obligate anaerobe)
절대 혐기성균이라고도 하며, 산소를 이용하지 못할 뿐만 아니라 산소는 균체에 유독하다.   

Clostridium 속 , Methanobacterium 속 등이 여기에 속한다.

내성 혐기성균(aerotolerantanaerobe)
산소가 존재하는 환경에서 생육할수없지만 생존이 가능하거나 혹은 호기적인 환경 하에서 약간 생육할 수 있다.

통성 혐기성균(facultative anaerobe)
산소를 이용하기도 하며, 산소가 없어도 증식한다. 산소가 있는 쪽이 생육이 좋다.

대장균, 효모 등이 있다.

미호기성균(microaerobe)
대기(大氣) 산소 농도보다 낮은 농도(2∼10%)의 산소를 필요로 하며, 이보다 높은 산소농도에서는 증식하지 않는다.

수소산화균등이있다.

편성 호기성균(obligate aerobe)
증식에 산소를 필요로 하는 미생물로 곰팡이 등이 여기에 속한다.

산소 농도에 따른 미생물의 생육상태

미생물 반응의 특징 장점과 단점을 명확히 알기

미생물 반응은 공업화의 소재로 여러 이점이 있다.

1. 미생물은 경우에 따라 유익한 "생화학적" 물질을 분비하거나 분비를 유도할 수 있다.

2. 미생물의 증식속도는 고등생물에 비해 매우 빠르다.

3. 미생물의 생산성은 전통적인 농업에 비해 매우 높다.

여러 장점에도 불구하고 다음과 같은 단점이 있다.

1. 배양조건에 따라 생리적 또는 형태적으로 매우 복잡하게 변한다.

2. 배양 중 변이가 발생하는 등 균주의 활성을 장기간 유지하기 어렵고, 새로운 균주를 개발하는 데 비용이 많이 든다.

여기서는 생물화학공학의 전반적인 내용을 공부할 예정이다.

교재는 "개정판 생물공학"

이 책은 텍스트 위주로, 기본적인 지식들은 대부분 언급없이 뛰어넘은 책?! 이라한다.

생물학은 양이 방대하므로 이 중에서 학습목표를 상기해가며 공부해야 한다.

화학적 반응을 통한 분리, 정제, 제품 생산이 학습목표이다.

생물화학공학의 "반응, 대상물질, 반응촉매, 반응조건, 분리공정, 멸균여부, 반응열, 공정제어 및 최적화"을 중점으로 공부하려 한다.

생물공학의 정의

생체의 물질 변환 기능, 정보 변환 기능, 에너지 변환 기능 등의 다양한 기능을 화학제품이나 의약품 등과 같은

유용물질의 생산, 품종개량, 생명현상의 해명 등에 합리적으로 응용하는 기술.

물리 및 화학의 원리를 응용해 인간에게 유용한 물질을 생산하는 시스템을 설계하고

화학공정을 구축하는 방법에 대해 배우므로 수학, 물리, 화학 등을 학습해야 한다.

발효 기술 및 유전자 재조합으로 만들어진 미생물이나 세포 융합을 이용하는 기술이라고도 할 수 있다.

생물화학공학 분야

생물반응기의 운용, 생화학공정의 계측 및 제어, 유용물질의 분리 및 정제기술 등